Метод тестирования имплантационных материалов на клеточных культурах
А. А. Долгалев
д. м. н., главный врач ООО «Северо-Кавказский медицинский учебно-методический центр» (Ставрополь)
Наиболее прогрессивным способом реконструкции дефектов зубных рядов, прикуса и жевательной функции, основанным на применении новейших технологий, является имплантация. Зубные имплантаты могут быть альтернативой многим ортопедическим методам лечения и создают для пациентов преимущества психологического, физиологического, профессионального и социального плана. Спектр возможностей дентальных имплантатов весьма широкий — от замещения одного зуба до восстановления зубного ряда полностью беззубой челюсти.
Основными требованиями к материалам для имплантатов являются:
— клинико-биологические, определяемые особенностями взаимодействия живых тканей с материалом имплантата;
— биологические, связанные с токсикологическими, канцерогенными, коррозионными свойствами материала имплантата;
— технологические, определяемые особенностями обработки имплантатов и зубных протезов;
— экономические, определяемые стоимостью материала и затратами на производство имплантатов.
Для стоматологической имплантации в токсикологической лаборатории ВНИИИМТ РФ разрешено применять в клинике следующие материалы: нержавеющая сталь 40Х13, кобальтохромовый сплав, корундовая керамика, никелид титана, титан.
Титан впервые был использован для остеосинтеза G. Levanthol (1951). Металлический титан плавится при температуре 1690 C, имеет плотность 4,5 г/см3. В настоящее время применяется титан ВТ 1-0 и ВТ 1-00 (соответственно, 99,53 и 99,48 % чистоты). Степень очистки титана определяется наличием в его составе небольших количеств (примерно 0,5 %) кислорода, азота, водорода, железа и углерода, которые ухудшают свойства титана (Donachie M. H., 1984). Титан нашел применение в имплантологии благодаря своим механическим и физическим свойствам. Данный материал обладает минимальными значениями текучести, низким модулем упругости, низким удельным весом, хорошей ковкостью и низкой теплопроводностью (OBrein W., 1990).
Для эффективного использования различных видов имплантационных материалов необходимо иметь четкое представление о механизмах их воздействия на различные ткани организма. Эффективным методом исследования такого типа проблем является эксперимент на живых объектах.
В настоящее время наиболее этичным методом исследований на живых объектах является исследование in vitro на культурах клеток.
В Самарском тканевом банке ЦНИЛ разработан комплексный метод оценки морфофункционального состояния коллагенсинтезирующих культур клеток в условиях имплантации различных биопластических материалов и образцов дентальных имплантатов на основе титана.
Исследование проведено на первичных культурах дермальных фибробластов и мезенхимальных стромальных клетках человека. Культуру дермальных фибробластов получали из кожно-мышечной ткани, а культуру мезенхимальных стромальных клеток (остеобластов) — из фрагментов крыши черепа абортного материала. Такие клетки по отношению к тестируемым биоимплантатам из костной ткани человека являются аллогенными, так как принадлежат разным особям одного и того же вида.
Клетки в присутствии исследуемого материала культивировали 4 суток.
Нативную культуру изучали, морфометрировали и фотографировали с помощью инвертированного микроскопа «Биолам П — 2-1» при увеличении 100 и 150.
Ежедневно проводили визуальные наблюдения и морфометрию нативной культуры. Визуально оценивали целостность монослоя, наличие слущенных клеток в культуральной жидкости, форму и размеры клеток, структуру клеток.
При пересеве забирали из экспериментальных и контрольных флаконов культуральную среду, в которой исследовали содержание общего белка, свободного и белковосвязанного оксипролина, фибронектина. При этом в культуральной среде определяли уровень белковосвязанного и свободного оксипролина (методика оформлена патентом на изобретение, как новый метод оценки секреторной активности клеток), уровень общего белка и фибронектина.
Полученные результаты
В 1-й серии экспериментов. Образец исследуемого материала (фрагмент стержня из титана — диск диаметром 3 мм, толщиной 2 мм и массой 65 мг) помещали на равномерный монослой фибробластов плотностью 332 клетки/мм2. При световой микроскопии все поверхности диска выглядели гладкими и блестящими.
Рис. 1а, 1б. Адгезия фибробластов к поверхности титанового образца.
Через сутки обращало на себя внимание нарастание плотности монослоя в непосредственной близости от образца. Более того, в ходе эксперимента фибробласты прилипали к ребру образца и поднимались по нему вверх, образуя по всему периметру диска утолщение в виде валика (рис. 1).
Рис. 2. Сцепление имплантата с культуральной средой (при переворачивании чашки).
Сцепление клеток с металлом было столь прочным, что уже на 3-и сутки опыта образец оставался неподвижным на дне культуральной чашки при любом изменении ее положения (вплоть до того, что чашку можно было перевернуть вверх дном и держать так неограниченное время (рис. 2). На всей остальной поверхности дна опытной чашки монослой был целостным и равномерным, фибробласты сохраняли обычную структуру, форму и размеры. Вид монослоя и структура клеток не отличались от обычных в течение всех четырех суток наблюдения. Количество поврежденных клеток было в пределах 2—5 %. Плотность монослоя и время удвоения культуры в контроле и опыте различались незначительно (табл. № 1).
Таблица № 1. Количественные характеристики культуры фиброластов при помещении на монослой фрагмента стержня из титана
Плотность монослоя (кл./мм²) |
Время удвоения культуры (часы) |
Количество слущенных клеток (кл./мл) |
Соотношение живых и мертвых клеток (%) |
Количество поврежденных клеток (%) |
|
Контроль |
332±67 643±51 1191±77 1988±49 2020±56 |
24 24 24 |
56 |
81:19 |
2 2,3 2,7 3,1 3,4 |
Опыт |
332±67 661±54 1182±93 1996±98 2012±104 |
24 24 24 |
2 2,5 2,8 3,0 3,5 |
2-я серия экспериментов. На дно культуральных чашек помещали образец исследуемого материала (фрагмент стержня из титана — диск диаметром 3 мм, толщиной 2 мм и массой 65 мг), после чего высевали фибробласты в концентрации 20 000 клеток/см2. Наблюдение через сутки показало, что фибробласты пристают к дну культуральной чашки преимущественно вблизи образцов, при этом тела клеток располагаются вдоль периметра исследуемых дисков (рис. 3).
Рис. 3. Концентрическое расположение фибробластов в культуре.
В отдаленных зонах фибробласты образуют редкий равномерный монослой, плотность которого в последующие сроки увеличивается с обычной для данной культуры скоростью, поэтому к концу наблюдения плотность насыщения не достигается. Со вторых суток вблизи образцов фибробласты образуют второй слой клеток, а на четвертые сутки мы видим вокруг них такой же «валик», который мы наблюдали в 5-й серии экспериментов (табл. № 2).
Таблица № 2. Количественные характеристики культуры фиброластов при тестировании образца стержня из титана
Плотность монослоя (кл./мм²) |
Время удвоения культуры (часы) |
Количество слущенных клеток (кл./мл) |
Соотношение живых и мертвых клеток (%) |
Количество поврежденных клеток (%) |
|
Контроль |
332±67 643±51 1191±77 1988±49 |
24 24 24 |
54 |
83:17 |
2 2,3 2,7 3,1 |
Опыт |
201±49 438±39 912±75 1896±99 |
24 23 24 |
57 |
84:16 |
2 2,4 2,6 3,2 |
Количество поврежденных клеток было в пределах 2—5 %. Плотность монослоя и время удвоения культуры в контроле и опыте различались незначительно. Эти данные свидетельствовали об отсутствии пролиферативной функции у данного материала.
Выводы
Методы клеточных технологий позволили выявить новые факты о взаимодействии различных образцов клеточных культур с поверхностью имплантатов.
Методы тестирования, основанные на клеточных технологиях, являются объективными и эффективными методами исследования имплантологических материалов и отвечают современным стандартам и требованиям биоэтики.