Метод тестирования имплантационных материалов на клеточных культурах

А. А. Долгалев

д. м. н., главный врач ООО «Северо-Кавказский медицинский учебно-методический центр» (Ставрополь)

Наиболее прогрессивным способом реконструкции дефектов зубных рядов, прикуса и жевательной функции, основанным на применении новейших технологий, является имплантация. Зубные имплантаты могут быть альтернативой многим ортопедическим методам лечения и создают для пациентов преимущества психологического, физиологического, профессионального и социального плана. Спектр возможностей дентальных имплантатов весьма широкий от замещения одного зуба до восстановления зубного ряда полностью беззубой челюсти.

Основными требованиями к материалам для имплантатов являются:

— клинико-биологические, определяемые особенностями взаимодействия живых тканей с материалом имплантата;

— биологические, связанные с токсикологическими, канцерогенными, коррозионными свойствами материала имплантата;

— технологические, определяемые особенностями обработки имплантатов и зубных протезов;

— экономические, определяемые стоимостью материала и затратами на производство имплантатов.

Для стоматологической имплантации в токсикологической лаборатории ВНИИИМТ РФ разрешено применять в клинике следующие материалы: нержавеющая сталь 40Х13, кобальтохромовый сплав, корундовая керамика, никелид титана, титан.

Титан впервые был использован для остеосинтеза G. Levanthol (1951). Металлический титан плавится при температуре 1690 C, имеет плотность 4,5 г/см3. В настоящее время применяется титан ВТ 1-0 и ВТ 1-00 (соответственно, 99,53 и 99,48 % чистоты). Степень очистки титана определяется наличием в его составе небольших количеств (примерно 0,5 %) кислорода, азота, водорода, железа и углерода, которые ухудшают свойства титана (Donachie M. H., 1984). Титан нашел применение в имплантологии благодаря своим механическим и физическим свойствам. Данный материал обладает минимальными значениями текучести, низким модулем упругости, низким удельным весом, хорошей ковкостью и низкой теплопроводностью (OBrein W., 1990).

Для эффективного использования различных видов имплантационных материалов необходимо иметь четкое представление о механизмах их воздействия на различные ткани организма. Эффективным методом исследования такого типа проблем является эксперимент на живых объектах.

В настоящее время наиболее этичным методом исследований на живых объектах является исследование in vitro на культурах клеток.

В Самарском тканевом банке ЦНИЛ разработан комплексный метод оценки морфофункционального состояния коллагенсинтезирующих культур клеток в условиях имплантации различных биопластических материалов и образцов дентальных имплантатов на основе титана.

Исследование проведено на первичных культурах дермальных фибробластов и мезенхимальных стромальных клетках человека. Культуру дермальных фибробластов получали из кожно-мышечной ткани, а культуру мезенхимальных стромальных клеток (остеобластов) из фрагментов крыши черепа абортного материала. Такие клетки по отношению к тестируемым биоимплантатам из костной ткани человека являются аллогенными, так как принадлежат разным особям одного и того же вида.

Клетки в присутствии исследуемого материала культивировали 4 суток.

Нативную культуру изучали, морфометрировали и фотографировали с помощью инвертированного микроскопа «Биолам П 2-1» при увеличении 100 и 150.

Ежедневно проводили визуальные наблюдения и морфометрию нативной культуры. Визуально оценивали целостность монослоя, наличие слущенных клеток в культуральной жидкости, форму и размеры клеток, структуру клеток.

При пересеве забирали из экспериментальных и контрольных флаконов культуральную среду, в которой исследовали содержание общего белка, свободного и белковосвязанного оксипролина, фибронектина. При этом в культуральной среде определяли уровень белковосвязанного и свободного оксипролина (методика оформлена патентом на изобретение, как новый метод оценки секреторной активности клеток), уровень общего белка и фибронектина.

Полученные результаты

В 1-й серии экспериментов. Образец исследуемого материала (фрагмент стержня из титана диск диаметром 3 мм, толщиной 2 мм и массой 65 мг) помещали на равномерный монослой фибробластов плотностью 332 клетки/мм2. При световой микроскопии все поверхности диска выглядели гладкими и блестящими.

Рис. 1а, 1б. Адгезия фибробластов к поверхности титанового образца.

Через сутки обращало на себя внимание нарастание плотности монослоя в непосредственной близости от образца. Более того, в ходе эксперимента фибробласты прилипали к ребру образца и поднимались по нему вверх, образуя по всему периметру диска утолщение в виде валика (рис. 1).

Рис. 2. Сцепление имплантата с культуральной средой (при переворачивании чашки).

Сцепление клеток с металлом было столь прочным, что уже на 3-и сутки опыта образец оставался неподвижным на дне культуральной чашки при любом изменении ее положения (вплоть до того, что чашку можно было перевернуть вверх дном и держать так неограниченное время (рис. 2). На всей остальной поверхности дна опытной чашки монослой был целостным и равномерным, фибробласты сохраняли обычную структуру, форму и размеры. Вид монослоя и структура клеток не отличались от обычных в течение всех четырех суток наблюдения. Количество поврежденных клеток было в пределах 25 %. Плотность монослоя и время удвоения культуры в контроле и опыте различались незначительно (табл. № 1).

Таблица № 1. Количественные характеристики культуры фиброластов при помещении на монослой фрагмента стержня из титана

 

Плотность монослоя (кл./мм²)

Время удвоения культуры

(часы)

Количество слущенных клеток (кл./мл)

Соотношение живых и мертвых клеток (%)

Количество поврежденных клеток

(%)

Контроль

332±67

643±51

1191±77

1988±49

2020±56

24

24

24

56

81:19

2

2,3

2,7

3,1

3,4

Опыт

332±67

661±54

1182±93

1996±98

2012±104

24

24

24

   

2

2,5

2,8

3,0

3,5

2-я серия экспериментов. На дно культуральных чашек помещали образец исследуемого материала (фрагмент стержня из титана диск диаметром 3 мм, толщиной 2 мм и массой 65 мг), после чего высевали фибробласты в концентрации 20 000 клеток/см2. Наблюдение через сутки показало, что фибробласты пристают к дну культуральной чашки преимущественно вблизи образцов, при этом тела клеток располагаются вдоль периметра исследуемых дисков (рис. 3).

Рис. 3. Концентрическое расположение фибробластов в культуре.

В отдаленных зонах фибробласты образуют редкий равномерный монослой, плотность которого в последующие сроки увеличивается с обычной для данной культуры скоростью, поэтому к концу наблюдения плотность насыщения не достигается. Со вторых суток вблизи образцов фибробласты образуют второй слой клеток, а на четвертые сутки мы видим вокруг них такой же «валик», который мы наблюдали в 5-й серии экспериментов (табл. № 2).

Таблица № 2. Количественные характеристики культуры фиброластов при тестировании образца стержня из титана

 

Плотность монослоя (кл./мм²)

Время удвоения культуры

(часы)

Количество слущенных клеток (кл./мл)

Соотношение живых и мертвых клеток (%)

Количество поврежденных клеток

(%)

Контроль

332±67

643±51

1191±77

1988±49

24

24

24

54

83:17

2

2,3

2,7

3,1

Опыт

201±49

438±39

912±75

1896±99

24

23

24

57

84:16

2

2,4

2,6

3,2

Количество поврежденных клеток было в пределах 25 %. Плотность монослоя и время удвоения культуры в контроле и опыте различались незначительно. Эти данные свидетельствовали об отсутствии пролиферативной функции у данного материала.

Выводы

Методы клеточных технологий позволили выявить новые факты о взаимодействии различных образцов клеточных культур с поверхностью имплантатов.

Методы тестирования, основанные на клеточных технологиях, являются объективными и эффективными методами исследования имплантологических материалов и отвечают современным стандартам и требованиям биоэтики.

comments powered by HyperComments
Похожие статьи

Подписывайтесь на еженедельный дайджест новых публикаций